C-kit-D816V稳定表达细胞系的构建及药物筛选

目的在红白血病和HCD57细胞株建立具有表达人干细胞因子（SCF）受体的c－kit基因突变小鼠，用于筛选抗癌小分子药物。方法以人c-kit－D816V基因突变质粒为模板，设计并合成引物。PCR扩增·c－kit基因被逆转录病毒载体的限制性内切酶EcoR消化，pMSCV－c－kit－D816V表达载体由同源重组法建造。重组质粒是通过酶消化和基因测序确定的。Lipofectamine3000将重组质粒和辅助性质粒联合转染到GP2－293细胞进行病毒包装。在荧光显微镜下观察转染效果，收集并浓缩病毒上清液。制备的逆转录病毒感染-HCD57细胞细胞系由甲基纤维素药物简编鉴定，c－kit基因的表达由流式细胞术鉴定。小分子靶向药物的筛选实验采用CCK－8方法进行。结果酶切结果显示，在重组质粒进行单酶切后，电泳后可看到693、2250和6488bp的三条DNA带，与载体和c－kit基因片段的大小一致。DNA测序的结果表明，c－kit基因成功地插入逆转录病毒表达载体。流式细胞术的检测结果显示，HCD57单克隆细胞系在感染后高度表达c-kit蛋白。CCK－8细胞增殖的实验表明，伊马替尼对HCD57-c-kit－D816V细胞的增长没有明显的抑制作用，而帕博西尼、达沙替尼和艾德拉尼对HCD57-c-kit－D816V细胞的增长有明显的抑制作用。结论成功构建了由逆转录病毒载体介导的c-kit蛋白稳定表达的HCD57细胞系基因，初步药物筛选实验成功。可用于抗癌小分子药物的筛选实验。