番茄分裂泛素酵母双杂膜系统cDNA文库及SlToc159诱饵载体的构建

叶绿体是植物进行高山、脂质代谢和氨基酸合成的重要地方。只有大约100座蛋白质由叶绿体自己的基因组编码，其余95%（约3000座）的叶绿体蛋白质，即前体蛋白，由核基因组编码。在细胞质中翻译后，它们通过TOC-TIC-转运蛋白复合体被引入叶绿体的特定位置，以发挥其生物学功能。Toc159是转运蛋白叶绿体的外膜，主要负责运输初期前体蛋白的特异性识别。为了研究番茄SlToc159与前体蛋白之间的相互作用机制，本实验以“Alisa·Craig”番茄为材料，从番茄幼苗的叶片中提取总RNA，利用Gateway技术构建分裂泛素化膜系统cDNA文库，在Toc159、AGM和pBT3－n-Toc构建诱饵载体pbt3-n-159gm，并用营养缺乏法检测其自激活活性。文库质量检测结果表明，该文库总容量为1.610~7CFU，文库效价为4.010~6CFUmL-1，外源基因插入片段为750~2000bp，重组率为100%，满足cDNA文库后续筛选互作蛋白的要求。酶切和测序结果表明，成功构建了截短区域a中的诱饵载体pbt3-n-Toc159 Leban和pbt3-n-GM，该诱饵载体可在分裂泛素化系统中正确表达，且无自激活活性。研究结果为番茄膜蛋白的筛选提供了理论依据。