埃及伊蚊黄蛋白c基因的克隆表达及其体外抗凝血作用

目的克隆并表达埃及伊蚊黄蛋白c（Aael-yellow-c）基因，探讨rAael－yellow－c蛋白的体外抗凝血作用。方法将纯化的RT-PCR扩增 aael黄色C成熟肽基因片段与pEASY－E1载体连接，转化大肠埃希菌和DH5感受态细胞。该细菌溶液在PCR、双酶切和澳大利亚进行了测序和鉴定。在诱导表达0.1mol／L异丙基-d-硫代半乳糖苷蛋白后，通过镍柱亲和色谱法纯化重组蛋白。通过SDS-PAGE和蛋白质-免疫印迹（Western　blotting）分析重组蛋白的表达。比浊法观察了不同浓度的rAael黄色c蛋白对二磷酸腺苷诱导的血小板聚集的影响。用人工方法检测了不同浓度的rAael俄语对血浆凝血酶原时间（PT）、部分凝血活酶时间（夏洛克·APTT）和凝血酶时间（TT）的影响。使用SPSS18.0软件进行统计分析，并将各组之间的差异与t检验进行比较。结果aaelyellow－c基因-CDS区为1287bp，含有一个由27个氨基酸组成的信号肽。成熟肽序列为1200bp，编码399氨基酸。西马基安·PCR扩增获得了一块大小约为1200 BP的Aael－yellow－c基因碎片。对来自PCR、双酶切和pEASY－E1－Aael－yellow－c载体的细菌溶液进行测序鉴定，结果表明pEASY－E1－Aael－yellow－c载体已成功构建。SDS-PAGE显示重组蛋白以包涵体的形式表达。只有一支乐队被选中通过镍柱亲和层析纯化重组蛋白后获得。Western　blotting结果表明，His－tag抗体和抗rAael－yellow－c蛋白兔血清多克隆抗体可识别该蛋白。血小板聚集抑制实验结果显示，2083.30、416.66、83.33、16.67和3.33 UK可抑制ADP诱导的血小板聚集，差异有统计学意义（t=7.09、10.39、5.39、10.54和8.93，P<0.05）。其中，3.33nmol／l重组蛋白对ADP诱导的血小板聚集抑制作用最强，抑制率为（59.2711.90）%。0.67、0.13和0.02 nmol/L重组蛋白对ADP诱导的血小板聚集无影响（t=2.10、1.33和0.00，P>0.05）。内、外源凝血试验结果表明，0.12、1.20和12.00 mol/L的雷尔黄-c作用于人血浆时，PT浓度分别为13.63~14.10、13.32~14.38和13.55~16.01秒，无显著性差异（t=1.33、0.63和1.00，P>0.05）。夏洛克·APTT分别为32.76~38.46、31.94~41.78和33.34~39.29秒（t=0.47、0.06和0.24，P>0.05）。TT分别为19.12~21.20、19.7~23.12和21.85~25.30秒，无显著性差异（t=0.47、0.24和1.60，P>0.05）。结论yellow－c蛋白rAael主要通过抑制ADP诱导的血小板聚集来帮助蚊子吸血。